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DNA鉴定-DNA测序原理

    大约30年前,科学家首次描述了DNA测序的Sanger法(Sanger  et  al.,1977)。现今DNA测序仍使用这项获诺贝尔奖的技术。测序过程中通过聚合酶结合作为链终止子的双脱氧核糖核苷酸(ddNTP),接着进行分离,分离介质必须可区分出单个碱基长度的差别ddNTPDNA核酸的3′末端无羟基基团,因此,当聚合酶结合一个ddNTP掺入到合成链时,链的延伸终止。反应体系中含有dNTPddNTP,部分DNA分子能够继续延伸。测序反应结束时反应混合液中含有一系列相互之间只相差一个碱基的分子。

    图1说明了Sanger测序法的过程。每一条DNA链均在独立反应中用单一引物进行测序,通常采用的是正向或反向PCR引物。用四种不同颜色荧光染料标记四种不同的ddNTP。红色染料标记ddTTP(胸腺嘧啶),蓝色染料标记ddCTP(胞嘧啶),绿色染料标记ddATP(腺瞟呤)和黄色染料标记ddGTP(鸟瞟呤),为了清晰分辨,黄色染料标记在屏幕上显示为黑色。荧光染料标记,以及自动化检测系统和毛细管电泳简化了DNA测序,人类基因组计划就是采用这些测序按术成的。

    Taq聚合酶在碱基结合过程中常常有很高的背景干扰,且结合率低,在过去IO年里,各种DNA测序法从单一的Taq聚合酶发展到今天所用的平衡性较好的Big Dye试翔盒。采用更易被荧光激发的染料提高了信噪比( Lee et a1.,1997),现在可从较少的检材中获得结果。现今每个DNA测序反应中仅需要Ing mtDNA PCR产物(Stewart et a1.,2003)

 

  DNA模板    3-TAAATGATTCC-5

5--------------3

    引物退火   A         ddNTP终止延伸

                    AT       产物以一个碱基的差额

                     ATT      依次递增

                      ATTT

                       ATTTA       每种ddMP标记不同

                        ATTTAC

                         ATTTACT    颜色的荧光染料

                          ArrTACTA

                           ATTTACTAA

                            ATTTACTAAG

                             ATTTACTAAGG

                  ATTTACTAAGG   根据电泳图谱中蜂的颜色确定序列

                  270        2          (进行单碱基检测)

                 图1荧光标记ddNTPDNA测序过程

    设计好的引物识别DNA模板的特定区域且发生退火,并在酶的作用下延伸。因为混合物中含有代表四种核苷酸的dNTPddNTP,一些延伸产物由于结合了一种ddNTP产生终止,而另外一些继续延伸。每种ddNTP用不同的染料标记使每种延伸产物能以颜色区分。DNA序列的读取基于延伸产物的片段大小,测序依赖的介质必须足以分清每个碱基。

    mtDNA测序PCR含下列几个步骤:①利用下列各种引物对整个或部分控制区进行PCR扩增;②去除PcR反应中残留的引物和dNTP,可以采用Microcon 100超滤法过滤或用虾一碱性磷酸酶核酸外切酶I进行酶消化(Dugan et al .,2002);③对PCR产物进行定量(Wilson et al.,1995a,1995b);④完成PCR测序反应,每个反应管中有一段不同的引物以及荧光标记的    ddNTP,这些引物可表明所检测的DNA链;⑤通常采用微柱过滤法去除在测序反应中未结合的荧光标记终止剂;⑥用甲酰胺稀释纯化后的测序产物并利用毛细管电泳或凝胶系统来进行分离;⑦进行序列分析及序列信息解释。

    DNA序可以利用一系列仪器完成,包括ABI 310ABI 3100ABI377( Stewart et a1.,2003)。可用多色荧光检测仪进行STR分析和mtDNA测序,其根本区别在于进行DNA序列分析要求分离介质必须能够区分单个碱基,而STR分型则无此严格要求。DNA测序常用POPTM-4分离胶,而STR分型采用POPTM-4分离胶,这种凝胶具有较低的黏性和分离度。

 

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