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亲子鉴定之制作过程中影响DNA检测效果的主要因素

    ()福尔马林固定

    甲醛有效固定作用的要点是在蛋白质末端基因之间形成交联链。参与甲醛固定蛋白质的基团,主要为氨基、亚氨基、酰胺基、肽、胍基、羟基、巯基和芳香环。甲醛与组织蛋白类的反应时多样和复杂的,因为它能和多种不同的功能基因结合,在多数情况下在其间形成桥键。甲醛这种交联的功能,虽然发挥了对组织固定的作用,但就DNA检测而言,却产生了不利的影响。正是因为DNA与蛋白质之间经广泛交联后形成牢固的复合物,阻碍了蛋白酶对组织的消化,从而影响甲醛固定石蜡包埋组织及病理切片的DNA提取,并阻碍其后PCR扩增过程中引物与模板的结合及引物的延伸。最为致命的是随固定时间延长,DNA分子会呈现可逆性亚氨基和氨基的羟甲基化,生物大分子之间缓慢形成广泛的亚甲基交联桥,导致DNA链的脆性增加,从而使其受到剪切力作用时,发生随机断裂,即通常所说的DNA降解,这是甲醛本身造成的DNA分子损伤。除此之外,甲醛与氧化性物质接触后形成的甲酸,可改变环境PH,从而影响DNA分子的稳定性,使核酸中嘌呤基的β-糖苷键容易发生水解而导致DNA链断裂。因此,很多实验结果表明,福尔马林固定时间越长,甲醛所致的DNA损伤越严重,越不易从获得大片段DNA

    (二)洗涤与脱水

    固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀,否则会影响以后的染色效果。多数用流水,固定后或洗涤后的组织内充满水分,如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋。乙醇为常用的脱水剂。

    ()      透明

    纯乙醇不能与石蜡相容,还需用能与乙醇和石蜡相容的媒浸液,替换出组织内的乙醇。材料块在这类浸液中浸渍,出现透明状态,此液即称透明剂,透明剂的浸渍过程称为透明。常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等,各种透明剂均是石蜡的溶剂。DNA可能在此间因解除多种化学试剂而发生结构改变。

    (四)浸蜡与包埋

    用石蜡取代透明剂,使石蜡浸入组织而起支持作用。在石蜡包埋过程中,DNA更容易发生降解,其可能的机制是组织浸蜡与包埋时需要加热到62℃左右,此时DNA部分解链,组织内残留的痕量甲醛可对解链后的DNA单链进行甲基化修饰,修饰后的DNA单链在冷却后不易复性而更易发生降解。另外,石蜡可阻碍消化液对组织的渗透,从而抑制蛋白酶K与组织内蛋白质的接触,影响组织消化和DNA释放。

    (五)切片

    通常切片厚度47µm。合适的切片厚度也是影响DNA提取的重要因素之一。切片过厚不利于组织脱蜡和蛋白酶消化,切片过薄易造成DNA的机械损伤。

    ()染色

    染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。染色剂种类繁多,经典的苏木精和伊红染色法是组织学标本及病理切片标本的常规染色,简称H.E染色。有时不同的组织结构还需要用特殊的染料及染色方法加以显示,即特殊染色。染料常常是PCR的抑制剂。

    染色后的切片尚不能在显微镜下观察,需经梯度乙醇脱水,在95%乙醇及纯乙醇中的时间可适当加长以保证脱水彻底;二甲苯透明后,擦去材料周围多余液体,滴加适量(12滴)中性树胶,再将洁净盖玻片倾斜放下,封片后即制成永久性玻片标本。

 

更多详情:北京科鉴基因亲子鉴定中心

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