DNA鉴定之SNPlex分型方法

      SNPlex系统通过对片段化后的模板进行连接反应，将连接产物纯化后用通用引物进行扩增，通过生物素与链霉亲和素的共价结合锚定在杂交板上后，用检测探针与锚定产物进行杂交，然后洗脱探针进行电泳分型检测(Tobler et a1．，2005; De LaVega et al.,2005)。
      寡核苷酸连接反应包括模板的活化和连接两个部分，活化是指在特定条件下利用分子的热碰撞原理使一定浓度、一定体积的模板DNA均匀分散为可使用的DNA片段，我们称之为片段化过程。分散为片段的模板DNA在ATP存在的条件下，与环境中的连接子和探针结合在一起，称为寡核苷酸连接反应。每个SNP位点的反应都会使用两个通用的连接子和三条位点相关的探针——分别是两条等位基因特异性寡棱苷酸探针和一条位点特异性寡核苷酸探针。对于一个SNP位点而言，在单链上仅是一个碱基的位置，在SNPlex系统中，位点之前的序列被设计成为等位基因特异性寡核苷酸探针ASO的一部分，而位点之后的序列被设计成为位点特异性寡核苷酸探针的一部分。等位基因特异性寡核苷酸探针ASO的另外一部分是具有标记性质的ZipCode序列，ZipCode序列可以和与之严格互补配对的ZipChute探针相结合。位点特异性寡核苷酸探针的另一部分由通用引物的反向互补序列构成。两个连接子中，等位基因特异性寡核苷酸探针连接子由带有通用引物的正向互补序列的部分和与ASO探针中ZipCode序列互补的部分，以及一个带有特异性酶切位点的发夹结构共同组成；位点特异性寡核苷酸探针连接子仅由一个带有特异性酶切位点的发夹结构和一段与通用引物的反向互补序列互补的部分构成。在特定条件下，探针会与模板互补结合，也会在ATP存在的条件下与其他部分连接在一起，形成一个半闭环结构。在特异性酶的作用下，单链DNA被水解，而具有保护性接头的连接产物得以纯化成为PCR反应的模板，并在含有单向生物素标记的通用引物作用下完成复合扩增。，将扩增产物加入固定右链霉亲和素的杂交板进行第一次杂交反应后，将没有杂交结合的产物洗脱，再加入与ZipCode序列严格互补配对的ZipChute探针进行第二次杂交，纯化并收集ZipChute探针进行电泳检测。