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DNA鉴定之RNA在种属鉴定中的应用研究

      在法医学实践中,有许多情况下需要鉴定检材的种属来源,如在现场发现的 可疑检材、涉及动物交通事故、偷猎的案件、食品药品监督和海关打击走私的生 物检材等。由于分子生物学技术的发展,种属鉴定进入了DNA分析的时代。用 核酸序列来进行生物检材种属鉴定最重要之处在于选择适当的基因或基因组片 段。mtDNA位于细胞核外,拷贝数约为核DNA的1000倍,其编码区在同种动 物内具有遗传稳定性。王闯等(2006)复合扩增mtDNA D环HVI、HVⅡ片 段和细胞色素b (Cytb)片段,根据聚丙烯酰胺电泳条带的数目区分人和10多种动物。田力等复合扩增mtDNA的16S rRNA相ND4基因,根据310电泳峰数目区分人和14种动物。但这些研究都只限于区分检材的人类与非人类来源,不能判断出动物的种类。Pa。。on等对Cytb基因扩增片段进行测序,分析序列同源性,区分了44个脊椎动物,但是测序较为耗时、复杂,在实际应用中受到限制。
      mtDNA的基因在种属鉴定方面研究较多的是细胞色素b基因(44%)、12SrRNA基因(11%)、16S rRNA基因(8%)和D环(8%)。叶懿等(2008)建立了一种用于种属鉴定的线粒体DNA 16S rRNA基因和细胞色素b基因荧光标记复合扩增检测体系。对mtDNA序列的16S rRNA基因和细胞色素b基因各设计一对引物,建立复合扩增体系,分别扩增人和牛、猪、狗、鸡、草鱼5种常见动物,用310遗传分析仪对产物进行分析。结果显示,人和5种动物D\A扩增产物均出现2个峰,Cytb通用引物的扩增产物为人与动物的共有峰.为358bp; 16S rRNA基因的扩增产物为人与动物间存在位置差异的特异峰,为231~256bp。该复合扩增体系可以明确区分人和5种动物样本,可用于种属鉴定。
       除了16S rRNA基因外,12S rRNA基因在种属鉴定中也受到重视。12SrRNA基因除具有mtDNA,适用微量、降解检材鉴定的特点外,还有以下优势。①序列资料齐全,利于比对判定。多数物种包括一些濒危物种的12S rRNA基因全长序列资料均可在GenBank中查到,扩增后有可参比序列资料,有利于判定种属和扩增的准确性。②扩增结果稳定可靠、可重复性好。既往的研究表明,扩增该基因的稳定性较好,不同实验室之间结果稳定。③12S rRNA基因的进化速R较快,不同物种间序列差异大,有利于设计针肘目标物种的高特异性引物。Rodriguez等(2003)对12S rRNA基因的研究表明,不需复合扩增,也不需多个退火温度,就可以实现多个物种利用同一反应条件进行鉴定,且无交叉扩增现象。这说明,12S rRNA基因比16S rRNA基因或D环具有更高的种属特异性。骆宏等(2008)从GenBank中获取人、鸡、鸭、鹅、猪、兔、鼠、绵羊、水牛、狗、山羊等11个物种的12S rRNA基因序列,设计一对针对上述11个物种的通用引物和分别针对人、鸡和鸭的特异引物,同时扩增各物种12S rRNA基因。以通用引物扩增片段为内部对照,以特异引物扩增片段用于人、鸡和鸭的种属鉴DNA分别对人、鸡、鸭单一检材,以及人和鸡、人和鸭、鸡和鸭等二元混合DNA进行鉴定。研究结果表明,通用引物扩增,各物种均有400bp左右的扩增片段;特异引物只对各自目标种属有扩增产物,片段大小分别是人163bp、鸡286bp、鸭374bp;测序结果与GenBank既有序列比对,Identities分值分别为:人100%、鸡99%、鸭100%;通用引物扩增人、鸡和鸭检材的灵敏度为2. 5pg;特异引物扩增灵敏度人为2. 5pg,鸡、鸭均为200pg;混合DNA中任一种DNA的含量只要高于检测灵敏度即可被准确检出,且不受另一种DNA量的干扰。
 

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