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DNA鉴定之SNP分型方法的四种基本原理

      1.杂交:在杂交法中,针对SNP位点及侧翼序列设计探针,通常探针间只有一个碱基的差异,分别对应于不同的等位基因。在优化的反应(杂交、洗脱等)条件下,单碱基错配足以破坏杂交体的形成,防止靶序列与错误的等位基因探针结合使其仅在序列完全匹配的情况下杂交。因为在分型反应中不掺入酶,杂交是最简单的机理。确保区分的难点在于探针设计。采用先进的探针设计方法和杂交增强分子,如DNA水沟结合分子(minor groove binding molecule),可提高探针设计的成功率。

      2.引物延伸:引物延伸反应的特异性表现在两个方面:①DNA聚合酶掺入与模板互补碱基的高度特异性(如测序);②DNA聚合酶引发延伸反应时要求PCR引物的3′端与靶DNA序列完全互补的严格性(如等位基因特异性PCR)。引物延伸法在应用中灵活性高,具有大量变化形式,所需引物和探针数目较少,并且探针设计和优化较为简便。
      3.连接:DNA连接酶在修复DNA分子缺刻时具有高度的序列特异性。两条相邻的寡核苷酸与模板退火,仅当其在接合处与模板完全匹配时才会在连接酶的作用下连接在一起,因而等位基因特异性寡核苷酸能够探查多态性位点碱基的性质。尽管连接反应在所有等位基因区分机理中最具特异性且最易优化,但它的反应速度最慢且需要大量的修饰探针。
      4.侵入切割:针对特定结构的切割酶能够切割部分重叠的寡核苷酸探针杂交形成的复合物。侵入切割(invasive cleavage)反应中需要使用两条分别对应于野生型和突变型的寡核苷酸探针和一条位于上游的侵入探针。设计探针时将多态性位点置于重叠处,正确的重叠结构仅在侵入探针和完全匹配的等位基因特异性探针间形成,而非单碱基错配的探针。切割产物用于产生信号的次级反应中。此信号放大步骤帮助捉高标记切割产物的量不经靶序列扩增即可实现检测。此方法的优点在于等温反应和无需PCR扩增即可分型,但尚存一些技术问题有待解决:①反应需大量基因组DNA;②需要高纯度的特异性探针才可忽略非特异性反应;③因为在相同条件下连续反应,而且SNP序列固定,所以探针设计较复杂。
 
 

 

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