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DNA鉴定之DNA甲基化检测方法的基本原理

       DNA甲基化检测方法的基本原理主要有三类。第一类是甲基化敏感性限制性内切核酸酶(methylation sensitive restriction endonuclease,MSRE)分析方法。此类方法主要是利用部分MRSE对所识别DNA序列甲基化的敏感性不同 (Khulan et al,2006; Ordway et a1.,2006)。例如,HpaⅡ及其同切酶Msp I均可识别序列C-CGG(7为酶切位点),但经DNA甲基化形成C- mCGG时, HpaⅡ将不能切割,而Msp工仍可切割。利用MSRE的这一特性,对基因组

      DNA进行酶切后,再采用对酶切后基因组DNA进行检测,即可明确所检测位点的甲基化状态。这一类方法的共同优点是,限制性内切核酸酶酶切对模板DNA的影响较小,因而可用于像石蜡包埋组织DNA甲基化状态的检测。其共同缺点是检测结果会受到酶切是否完全的影响,并且也只能分析限制性内切核酸酶识别序列中的CpG位点。
       第二类是通过对基因组DNA中的胞嘧啶进行化学修饰,以区分未甲基化的胞嘧啶和5-mC,最常用的是重亚硫酸盐转化(吴超群等,2007)。在DNA单链中,未甲基化的胞嘧啶在高浓度的重亚硫酸盐作用下经一系列化学反应后可转化成尿嘧啶(U),而5-mC则保持不变。在随后的PCR过程中,尿嘧啶(U)被转换为胸腺嘧啶(T),如此就将胞嘧啶的甲基化修饰这种化学修饰信息转化为序列差异信息。目前,经改良的重亚硫酸盐转化后末端终止测序分析技术已成为DNA甲基化分析的金标准,焦磷酸盐测序方法同样可用于重亚硫酸盐转化后DNA序列的测序分析。
       第三类是采用甲基化CpG特异性结合蛋白(Methyl-CpG-binding domain protein,MeCP),该蛋白家族包括MeCPl和MeCP2等。以MeCP为填充物开发的MBD柱层析法常用于基因组范围内的甲基化位点扫描(Yegnasubramanian et al_,2006; Shiraishi et al.,2004)。
        现今文献报道的各种DNA甲基化分析方法均依赖于这三种基本原理。最近已有学者在研究更为温和的5-mC化学修饰方法(Okamoto,2009)或5-mC光交联斌剂(Ogino et a1.,2008),如采用锇酸盐的化学修饰方法,这些均可能成为重亚硫酸盐法的一种理想替代方案。
 
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