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DNA鉴定之基因组范围内的DNA甲基化状态扫描方法

      5-mC占基因组胞嘧啶数的百分比(s-mCY6)可作为一个粗略评定基因组甲基化状态的指标。将样品DNA通过酶解或氢氟酸盐等水解为单碱基后,经高效液相( HPLC)或高效毛细管电泳(HPCE)等方法分离,对胞嘧啶和5-mC进行曲线下面积积分,通过计算[5mC/( 5mC+C)]即可获得5-mC%,但这一指标的法医学应用价值有限。对全基因组DNA甲基化状态的检测方法多是基于MSRE或MeCP。

      基于MSRE的方法包括限制性标记基因组扫描(restriction landmark genomic scanning,RLMG)、甲基化敏感性限制性指纹图谱技术(methylation-sen-sitive restriction fingerprinting technique,MSRF)、内部甲基化位点扩增技术(amplication of inter-methylated sites, AIMS)等多种(Huang et al.,1997)。RLMG是采用稀有切点的甲基化敏感限制性内忉核酸酶Not工酶切后进行二维电泳,可对约50%的基因组CpG岛进行扫描;MSRF是采用Mse工、BstU I等对基因组酶切后用10碱基的随机PCR引物进行扩增-这两种方法往往伴随着大量的后续鉴定工作,操作复杂。AIMS采用的是可识别同一序列但甲基化敏感性不同的限制性内切核酸酶(如前文提到的HpaⅡ一Msp I)对基因组进行酶切后,加入接头序列进行连接反应,接头序列包含通用引物序列,可进行PCR扩增。AIMS扩增条带的复杂程度较前两种方法显著降低,可直接进行克隆测序。Khulan等(2006)基于Hp口Ⅱ-M。pl限制性内切核酸酶对的特性对AIMS进行了改良,称之为HELP (HpaⅡtiny fragment enrichment by ligation-mediatedPCR),该方法是将HpaⅡ和M,pl酶切后接头引物的扩增产物分别采用不同荧先进行标记,随后进行芯片杂交检测。基于HpaⅡ的CpG甲基化检测芯片已成功应用于同卵双生子对基因组甲基化差异的扫描研究。此类方法的显著缺陷是受限于MSRE识别序列,如采用HpaⅡ仅能分析基因组内约8%的CpG岛。限制性内切核酸酶Mcr BC的应用是一个革命性的进步。Mcr BC区别于常用限制性内切核酸酶的一个显著特征是,它所识别的序列[RmC (N)ss~i。。RmC]具有高度的可变性,该酶约可识别基因组内半数的甲基化DV -A和几乎全部的CpG岛。Lippman等(2004)首次将Mcr BC应用于模式生物——拟南芥基因组DNA的甲基化扫描。随后,Ordway等(2006)将其应用于哺乳动物基因组DNA甲基化扫描,并开发了相应的检测芯片。
      基于MeCP特性的MBD柱层析法在全基因组甲基化状态扫描中也有广泛的应用。Yegnasubramanian等(2006)将MBD柱层析法与MSRE联用建立的COMPARE-MS (combination of methylated-DNA precipitation and methylation-sensitive restriction enzymes)方法,结合了MBD桂层析法与MSRE的共同优点,避免了单纯柱层析法的非特异性捕获和因MSRE酶切不完全所导致的假阳性问题。Luo等(2009)报道了一种基于MBD的DNA甲基化检测芯片技术。
      该方法中首先将基因组DNA进行重亚硫酸盐转化,随后采用PCR对转化后的基因组DNA目标区域进行扩增,并将PCR产物的一条DNA链固定在芯片上,与甲基化序列和未甲基化序列对应的探针进行杂交,再采用SssI甲基化酶对杂交形成的双链DNA进行甲基化修饰,则探针序列上的胞嘧啶亦形成5-mC,随后用经荧光标记的基因工程MeCP(命名为HMBD)进行结合,荧光强度即指示了目标DNA区域内的甲基化CpG位点密度。
      上述这些方法往往应用于肿瘤、胚胎发育等表观遗传学研究,但采用类似方法同样有利于发现具有潜在法医学应用价值的DNA甲基化位点。
 
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