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亲子鉴定之Chelex-100提取DNA

      Chelex-100提取DNA的方法最早由Singer - Sam等1989年报道,Walsh等(1991)对该法在法医物证检材中的应用进行了系统的研究。目前Chelex - 100提取DNA的方法已成为一种常规技术,广泛应用于生命科学各个领域。

      一、原理:Chelex - 100是以成对的亚氨基二乙酸盐离子为吸附因子的苯乙烯与二乙基苯的共聚物,它对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用。在低离子强度、碱性及煮沸的条件下,可以使细胞膜破裂,并使蛋白质变性,DNA游离。检材及其基质中含有大量的核酸酶和金属离子,Chelex - 100螯合吸附了金属离子后,能够抑制核酸酶对DNA的消化作用,防止DNA在煮沸过程中的降解作用,同时在高温、低离子强度条件下,还有催化DNA释放的作用。这样的处理过程既达到了分离提取DNA分子的目的,同时除去了一些对扩增反应有抑制作用的因子(如重金属离子)。

      二、基本操作步骤及方法:Chelex - 100提取法广泛应用于微量血液、组织块、精斑、毛根、唾液斑、骨骼及牙齿等物证检材的DNA提取,提取的DNA十分适合用作PCR模板,本节以微量血液为例,其他检材右关内容将在第4节叙述。
      基本操作步骤:
      (一)取血液l~5出,加入1.5ml离心管中,加入Iml纯水,室温下震荡混匀15—30min。
      (二)10000一12000r/min离心2~3min,弃上清。必要时用纯水洗涤1—2次;
      (三)室温下12000r/min离心3min,弃去上清,留下沉淀。
      (四)在离心管中加入200pl悬浮好的5010 Chelex - 100溶液,在56℃水浴中温浴30min以上,震荡溶液5~ 10s。
      (五)100 aC温浴8min,取出后高速震荡溶液5~10s。
      (六)室温下12000r/min离心3min。上清即为用于PCR反应的DNA样品。4。20C保存备用。
      注意事项:
      (一)本法仅适用于PCR反应模板制备,提取后短时间之内使用。
      (二)操作中振荡步骤需要充分。
      (三)灭菌去离子水破碎红细胞后,离心沉淀仍很红,可再加Iml灭菌去离子水充分振荡、离心,直至上清液无色。
      (四)可适当延长56℃温浴时间。
      (五)基因组DNA是在上清液中,通常情况下在501ul扩增体系中加入1。51ul样品足以满足PCR反应的需要,具体加多少取决于起始检材量。
      (六)Chelex - 100使用终浓度一般为5%, pH值应在10。11之间,如果pH值有改变应试用,不应人为调整Chelex - 100的pH值。
      (七)Chelex - 100放置后会沉淀,使用前必须混匀,用Chelex - 100提取的DNA模板如PC置时间长或从一个实验室携带到另一个实验室检验,扩增前应混匀后再离心,取上清液。PCR反应体系内绝对不能含有Chelex - 100,否则Mg“会被螯合,使PCR扩增失败。
      (八)Chelex - 100法提取DNA煮沸很关键,温度、时间要足够。
 
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