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DNA亲子鉴定之唾液(斑)DNA提取

唾液(斑)中含有脱落的口腔上皮细胞,唾液(斑)上皮细胞DNA的提取可采用有机溶剂提取法,Chelex - 100提取法和磷酸缓冲液法,具体操作如下:

1.有机提取法:

 (1)将适量标本剪碎置离心管中,加入Iml生理盐水轻轻混匀冲洗细胞,5000r/min离J心
10min,弃上清后再重复一遍。
 (2)在沉淀的上皮细胞中加入400t/l TES(15mmol/L Tris - HCl pH8.0,15mmol/L EDTA pH8.0, 15mmol/L NaCl),lOOoC温浴lOmin,冷却至室温再加10% SDS, lOmg/ml PK,使其终浓度分别为1%,lOOtLg/ml,37℃消化过夜。
 (3)等体积饱和酚和氯仿各抽提2次,上清用2.5倍体积冰无水乙醇沉淀,1000r/min离心lOmin,沉淀晾干,灭菌去离子水溶解备用(当样品中DNA含量很少时,如果用TE缓冲液溶解,其中的EDTA浓度过高,抑制TaqDNA聚合酶活性,所以此时建议用无菌水溶解DNA)。
2.Chelex - 100提取法:
 (1)将适量斑迹剪碎,加入装有200V1 5% Chelex溶液的离心管中。
 (2)特lOmg/ml蛋白酶K2阻加入管中,轻轻混匀。高速震荡溶液5~10s,一定要使沉淀悬浮起来。
 (3)在56℃水浴中温浴20min,高速震荡溶液5~10s。
 (4)100℃煮沸8min,高速震荡溶液5~10s。
 (5)在室温下15000r/min离心2min。上清用于PCR反应。4℃保存备用或-20℃储存。
3.磷酸盐缓冲液法:
 (1)将适量斑迹剪碎,置于装有Iml PBS缓冲液中,1500r/min离心5min,沉淀细胞,弃上清。
 (2)用50—300µl钾缓冲液悬起细胞沉淀。55℃消化1h(裂解细胞,释放DNA)。
 (3) 95℃水浴10min,灭活蛋白酶K,- 20℃保存备用。
(二)口腔拭子中DNA的提取
1.将其放入装有200til的5%c1.elex - 100的1.5ml离心管内,轻轻搅动,使细胞脱落。
2.56℃温Y15~30min,高速振荡5~10S。
3.100℃煮沸8min后立即高速振荡5~10s,15000r/min离心2min。上清即可用于进行PCR反应。
注意事项:
唾液斑检材DNA提取,检材加入量不易量化,应结合检材具体情况调整。建议如下:
1.烟蒂中能否提取出DNA与烟蒂是否沾有口腔脱藩上皮细胞有关,也与抽烟者抽烟时口含烟蒂多少的习惯有关,并不是所有烟蒂均能提取出足够量的染色体DNA用于检验,DNA的提取必需用沾有唾液或口唇上皮细胞的那部分检材。不能将整个烟蒂全部投入,否则过大的载体会影响DNA的提取。烟蒂检材一般剪取0.3~0.5cm高的烟蒂,将外层纸剪碎放入1.5ml离心管中;
2.口腔拭子是国外建立DNA数据库首选的检材,立法时它属体外标本。因此,用口腔拭子进行PCR分型很多见。取单根拭子头部的1/3~1/4装入1.5ml离心管中或用牙签刮拭口腔粘膜。
3.口香糖检材取1/2左右,用无菌剪刀尽量剪碎,放入1.5ml离心管,如含泥土等,先用无菌水洗干净。
4.咬痕唾液斑检材,纱布或棉拭子擦拭咬痕部位。用纱布提取的剪取0.1~0.2cm2,棉拭子取头部1/2外层部分。
 
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