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DNA鉴定之有机溶剂提取法提取骨、牙组织的DNA

骨骼、牙齿由于有外部硬组织的保护,因此能够抵抗外界环境的影响,DNA不易被降解,在软组织腐败或炭化的情况下,从软骨、骨骼、牙齿等硬组织中提取DNA是惟一的选择。肌体软组织高度腐败肌肉变黑,甚至液化的情况下,从软骨组织仍可能提取到DNA扩增分型的模板,所以软骨组织是理想的检材。对于骨骼、牙齿样本,宜选骨髓、牙髓,其次选择干骺端、其他骨松质丰富的部位,最后选择骨密质部分。

暴露在野外现场的骨骼、牙齿标本首先要进行清洗工作。将标本用蒸馏水冲洗干净、干燥,用灭菌细砂纸磨去骨外层部分,并在紫外灯下照射杀菌1~ 2h,以避免微生物或外源DNA的污染,再进行以下步骤。
       有机溶剂提取法:
1.较新鲜的骨骼
(1)钻取骨粉(胃松质10~20mg,骨密质75~100mg)或取牙髓,分别用冷蒸馏水、乙醇、乙醚各浸泡15min;
(2)待完全干燥后加TES(15mmol/L Tris-HCl pH8.0,15mmol/L EDTA pH8.0,15mmol/LNaCl) 400µl,10% SDS 40µl,10mg/ml蛋白酶K 4µl,混匀。37℃温浴过夜。
(3)饱和酚、氯仿抽提及冷乙醇沉淀,操作同血液DNA提取。应该注意的是此方法对较新鲜骨、牙的DNA提取效果较好,对陈旧骨、牙检材提取效果不佳。
2.陈旧骨骼
(1)取5g骨粉加入40ml 0.5mol/L EDTA pH8.0,4aC混匀24~48h。5000r/min离心15min,弃上清。
(2)用40ml提取缓冲液(0.5mol/L EDTA,0.5%蔗糖pH8.0)脱钙。5000r/min离心15min,弃上清。
(3)加入提取缓冲液使终体系达7ml,再加入10mg/ml蛋白酶K 200µl,37℃孵育12h,追加10mg/ml蛋白酶K100µl,37℃再消化12h。
(4)酚、氯仿抽提及冷乙醇沉淀,操作同血液DNA提取。必要时用centricon柱层析法浓缩。
 
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