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DNA亲子鉴定之荧光标记测序技术特点

      基本原理是双脱氧末端终止法,标记物选择荧光染料。荧光染料标记有2种方法:一种是标记引物,另一种是标记终止物ddNIP。荧光染料标记引物,操作方法相对复杂,如果选用一种荧光染料标记,则要分A、c、G、T四个单独的测序反应,然后再分别上样分析。如果用四种染料分别标记引物,按双脱氧ddNIP的不同分A、c、G、T四个单独的测序反应,上样时可将四个测序反应产物混合,合并在一个泳道内电泳,因此,荧光标记终止物ddNIP测序更有优势。将四种荧光染料分别标记在四种终止物ddNIP上,一个反应管内畏口可完成测序反应,操作简单、快速,对引物的选择、设计无特殊要求。该项技术的特征是测序反应后每一引物链延伸产物都因ddNIP标记物带有不同荧光染料,可在同一个泳道上样,经电泳分离后依据颇色将不同荧光波长特征性的谱带分开,同时激光检测器同步扫描,激发出的荧光经光栅分光后CCD(charge coupled device)摄像机上同步成像,再传人电脑,经软件分析可区别不同荧光区带,并确定靶片段的碱基序列。四色荧光染料标记终止物ddNTP的方法具有以下特点:①四个测序反应产物可以安排在一个泳道内电泳,避免了多个加样泳道间迁移率差异对精确度的影响。一次电泳分析的样品数可达36个或48个,改进电泳设备甚至可同时分析96个样品,检测效率明显提高。②技术方法简化,准确性高,序列结果稳定,克服了同位素标记方法的放射性污染缺点。③灵敏度高,极少量的PCR扩增产物如30ng就可以满足模板线性扩增的需要,获得足够量的序列分析产物,产生足够强的荧光信号。④测序能力强,速度快,高达200bp/J、时,36cm长的凝胶板可以准确测定900个碱基。⑤电泳分离自动化,应用DNA分析软件自动收集、处理和分析数据,大大降低了人工操作的劳动强度。⑥实验结果自动存储在计算机内,而且可以应用软件系统对资料作快速的查询。
      目前,已报道的荧光染料很多,PE公司产品主要有两种试剂盒,其他公司如Pharmacia公司的测序试剂盒,选用的荧光染料与PE公司基本相同。
      (1) Dye Temunation Cycle Sequencing Terminator kit (P/N402078)
      FS测序试剂盒,四色荧光标记物为Rll0、R6G、ROX、TAMRA,引物浓度一般为3.2pmol,反应体积为20til。
      (2) BigDye Termination Cycle Sequencing Terminator kit (P/N4303152)
      BigDye测序试剂盒采用的四色荧光标记物为:dR6G、dRll0、dTAMRA、dROX,引物浓度一般为3 .2pmol,反应体积为20vl。
          荧光标记对靶DNA片段直接测序反应的聚合酶,多是利用Taq DNA聚合酶。PE公司的测序试剂盒提供的酶类既有AmpliTaq DNA聚合酶,又有修饰过的T7 DNA聚合酶。Ampli TaqDNA聚合酶是一种超纯的热稳定聚合酶,为E.coli Taq DNA聚合酶经过修饰表达的产物,具有快速掺入核苷酸的特点。该酶没有3L5’外切酶的活性,耐94~ 96℃的高温,因此,是PCR循环测序较理想的聚合酶。应用Ampli Taq DNA聚合酶循环测序具有以下特点:
      (1)灵敏度高,对DNA模板量的要求较少,例如测定PCR产物序列仅需30ng模板量则可满足模板线性扩增的需要,能够获得足够量的序列分析产物,产生足够强的荧光信号:
      (2)可直接对单链、双链DNA模板及PCR产物进行测序,不需要对双链DNA变性,三种测序模板可采用相同的测序方案。但比较起来,对双链的PCR直接测序效果较好。
      (3)较高的反应温度减少了二级结构对序列测定的影响,使引物链能够更完全的延伸。
      (4)高温变性、退火减少了模板与引物间非特异性退火的机会,提高测序反应特异性:
 

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