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亲子鉴定检材DNA提取

    如何从各类生物检材中得到高质量的DNA,是法医DNA分析鉴定的关键,DNA样品质量的好坏将直接关系到实验的成败。人类基因组DNA 98%以上以染色质的形式存在于细胞核内,仅有少量存在于线粒体中。因此,来自人体组织的有核细胞均可提取到DNA分子。人体组织分结缔组织、肌肉组织、神经组织和上皮组织四大类,不同器官组织因其结构不同细胞含量有明显的差异,有核细胞越丰富的器官组织,DNA含量越丰富,DNA产率越高。正常人体器官组织DNA含量大约为脑>肺>肌肉>肾,有些实质性脏器DNA丰富,但人体死亡后降解迅速,故一般不用于法医DNA分析,如肝脏、脾脏等。正常人精液中精子数约为6千万~2亿个/ml,所以,精液中DNA量相对较多。血液中仅白细胞中含有核DNA,白细胞正常计数值在4百万—1千万个/ml,相对而言,血液中的DNA量就少得多了。理论上1个人类体细胞内大约含有6×109 bp的DNA,重量约6pg。据此推断Iml精液大约可提取0.36~ 1.2mg DNA、Iml血液大约可提取0.024~0.06mg DNA。各种现场物证检材(包括血痕、精斑及其与阴道分泌物的混合斑、带毛囊的毛发、组级块、骨骼以及沾有唾液斑的烟蒂等),只要含有一定数量的有核细胞或破碎的细胞核,均可提取到DNA。一些无核细胞检材,还可提取线粒体DNA进行分析。提取样本DNA通常分两个步骤,先是温和裂解细胞和溶解DNA,接着采用化学方法去除蛋白质、RNA及其他大分子,获得纯化的DNA样品。这个过程就叫做DNA提取或核酸提取。

    较理想的DNA样品应达到以下三点基本要求:

    (1)最大程度地去除样品DNA溶液中的RNA、蛋白质、多糖和脂类分子等成分;

    (2)尽可能地保持提取的DNA分子的完整性,这在DNA指纹分析中尤为重要;

    (3)减少或去除可能对酶有抑制作用的物质,如有机溶剂、去污剂、金属离子、染料及其他抑制DNA分析所用酶活性的物质。

    为了满足在法医DNA分析中不同检测技术对DNA样品的要求,在DNA提取过程中对DNA的质与量需周密考虑。

    首先,要考虑样品DNA的量。不同检测技术对DNA样品的量的要求不同,DNA指纹图分析要求检材DNA量达到腭水平以上。PCR技术因灵敏度高,检材DNA量一般达到ng水平,甚至pg就可以达到扩增、分型的目的。因此,应视检材具体情况及检验方法确定DNA提取方案。

    不同的人体组织中DNA含星差异较大,可获取DNA量也不相同,组织的类型是影响提取DNA量的重要条件。另外一个重要因素是各类案件现场检材常暴露在外界环境之中,受到的各种因素影响和损失难以估计。综合考虑生物检材的种类、检材的量、收集方式、收集地点环境、检材陈旧度以及检材基质种类等诸多因素,可对样品DNA量作一粗略预计,这是在DNA提取前就应考虑的问题。

    其次,要考虑样品DNA的质量。对法医DNA分析而言,高质量包括2个重要方面,一是DNA分子能否保持完整的分子结构,二是样品中对内切酶、TaqDNA聚合酶活性等有干扰的杂质是否完全去除。各类DNA分型技术对DNA分子的大小要求也不尽相同,但总的原则是尽可能取得完整的DNA,即高分子量DNA,这在DNA指纹图分析中尤为重要。生物检材DNA在受到各种理化因素的影响以及来自细菌腐败与自身组织分解而释出的蛋白酶、核酸酶的影响时,会发生降解。DNA长链状分子的降解断裂点是随机的,必然严重干扰RFIP的检测与分析。生物检材越陈旧,提取高分子DNA的可能性越小,这在DNA提取时应有充分的估计。DNA分子以染色质的形式存在,其机械强度毕竟有一定限度,尤其是DNA与组蛋白分离后,DNA分子变得更加脆弱,任何粗暴的操作、洗涤时所产生的剪切力均可造成DNA分子的损伤和断裂。在DNA指纹图分析过程中,在限制性核酸内切酶消化步骤前,必须对提取的样品DNA分子大小作一检测,因为这是DNA指纹分析成功的关键之一。相比之下,PCR技术对DNA分子量的要求则没有这么严格,不论采用何种提取技术,尽量去除对DNA分析有关酶类活性有干扰的物质是十分重要的。

    DNA提取方法有很多,目前常规应用的方法主要有两类,有机溶剂提取和Chelex - 100提取法。

 

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